300 kd:n onttokuituultrasuodatus: tehokkaan-konsentrointi- ja puhdistusprosessin analyysi jalka-ja-suutatauti O/A-virukselle

Johdanto

Suu- ja sorkkatauti (FMD) on akuutti, kuumeinen ja erittäin tarttuva eläintauti, jonka aiheuttaa suu- ja sorkkatautivirus (FMDV). Tämä virus vaikuttaa sorkkaeläimiin, joihin kuuluu yli 70 herkkiä lajia. Se leviää nopeasti ja sen sairastuvuusaste on korkea. Se vaikuttaa tyypillisesti suuriin kotieläimiin, kuten sioihin, lampaisiin ja nautaeläimiin, joissa ilmaantuvuus voi nousta 100 prosenttiin. FMDV kuuluu sukuunJalka{0}}ja-suuvirusMicroRNAviridae-heimoon. Partikkelit ovat pallomaisia, halkaisijaltaan noin 27-30 nm, ja ehjien viruspartikkelien sedimentaatiokerroin on 146S. Tällä hetkellä on saatavilla erilaisia ​​suu- ja sorkkatautirokotteita, mukaan lukien heikennetyt elävät virusrokotteet, elävät virusvektorirokotteet, inaktivoidut rokotteet, nukleiinihapporokotteet, synteettiset peptidirokotteet ja alayksikkörokotteet. Inaktivoiduilla suu- ja sorkkatautirokotteilla on yleensä vähemmän sivuvaikutuksia eläimillä, ja moniarvoiset rokotteet tarjoavat paremman immunisaatiotehon, mikä tekee niistä Kiinan suu- ja sorkkataudin ehkäisyn tukipilarin.

Tangentiaalivirtauksen ultrasuodatus

Tangentiaalivirtausultrasuodatus on tällä hetkellä yleisesti käytetty puhdistus- ja väkevöintimenetelmä suu-suu- ja sorkkataudin moniarvoisten inaktivoitujen rokotteiden laajamittaisessa tuotannossa. Tällä menetelmällä ei vain saavuteta haluttua pitoisuustekijää, vaan myös poistetaan suuri määrä vieraita epäpuhtauksia. Tangentiaalivirtausultrasuodatusta käytetään pääasiassa puhdistukseen, väkevöintiin ja suodatukseen (suolanpoisto ja puskurin korvaaminen). Lisäksi sitä voidaan käyttää myös käymisliemen tai soluviljelyalustan kirkastukseen tangentiaalivirtausmikrosuodatuksella, jolloin se korvaa sentrifugoinnin tai primääriselkeyttämisen.

Perinteisessä pystysuorassa suodatuksessa suurilla molekyyleillä on taipumus aggregoitua kalvon pinnalle tukkien suodattimen. Tangentiaalinen virtaussuodatus sallii kuitenkin virtauksen edetä yhdensuuntaisesti kalvon kanssa välttäen tämän tukkeutumisongelman. Tangentiaalivirtaussuodatuksessa kalvon läpi tunkeutuvaa liuotinta ja kalvon huokoskokoa pienempiä aineita kutsutaan permeaatiksi, kun taas huokoskokoa suuremmat aineet jäävät tiivisteeksi. Yhdessä optimoitujen pesu- ja suodatusprosessien kanssa voidaan saavuttaa erikokoisten molekyylien erottaminen ja puhdistaminen. Tämä tekniikka tarjoaa etuja, kuten alhaiset kustannukset, kevyet käyttöolosuhteet, kätevän puhdistuksen ja vaihdon, suuren kalvon permeaatin virtausnopeuden ja yksinkertaisen käytön, mikä tekee siitä erityisen sopivan bioaktiivisten aineiden laajamittaiseen konsentroimiseen ja puhdistukseen.

Materiaalit ja menetelmät

Tulokset ja keskustelu

Mitä tulee viruksen alkupuhdistukseen, ultrasuodatuskonsentraatiolla saavutetaan yli 90 %:n poistonopeus epäpuhtauksille, kuten proteiineille, jotka eivät sisällä viruksia. Tilavuuden suhteen se voi saavuttaa korkeita pitoisuuksia, 10-50-kertaisia, mikä tarjoaa vahvan tuen myöhempään puhdistukseen. Onttokuitukolonni, jonka molekyylipainoraja on 300 kd, valitaan. Tämä huokoskoko, vaikka se säilyttää yli 85 % viruksesta, voi poistaa yli 90 % epäpuhtauksista proteiineista. Kalvopinta-ala on 1600 cm2 ja läpijuoksu 2-5 ml/cm2, mikä mahdollistaa ultrasuodatuskonsentroinnin suorittamisen loppuun tehokkaassa ajassa (2 tunnin sisällä). Yksityiskohtaiset ultrasuodatuskonsentraatio- ja puhdistustiedot on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1. Suu{1}}- ja -sorkkatautiantigeenien (tyypit O ja A) kokonaishavaitsemisen tulokset

Puhdistusmenetelmän huomioitavaa

Tällä hetkellä on olemassa erilaisia ​​puhdistusmenetelmiä, mutta jopa samalla menetelmällä samalle antigeenille puhdistusvaikutus on usein epätyydyttävä monista syistä, mukaan lukien antigeenin karakterisointi ja prosessiparametrit. Esimerkiksi muutokset ylävirran molekyylisuunnittelussa tai fermentaatioviljelyjärjestelmissä voivat muuttaa viruksen molekyylirakennetta, mikä johtaa epätyydyttäviin puhdistustuloksiin. Sopimattomat selkeytysmenetelmät voivat lisätä raaka-ainekustannuksia tai heterologisen proteiinin määrää, mikä lisää painetta myöhempään puhdistukseen. Virheellinen ultrasuodatuskonsentraatio, kuten erilaiset ultrasuodatuskalvon huokoskoot, konsentraatio- ja eluointitekijät, sisääntulon virtausnopeudet, suodatusnopeudet ja TMP, voivat johtaa alhaisiin antigeenin talteenottonopeuksiin. Laaja käytäntö osoittaa, että huono puhdistus voi aiheuttaa merkittäviä haittavaikutuksia eläimissä immunisoinnin jälkeen, mikä voi johtaa kuolemaan.