TFF-tangentiaalivirtaussuodatus yhdistettynä ultrasentrifugointiin tehokkaaseen pienten ekstrasellulaaristen rakkuloiden valmistukseen

Pienet ekstrasellulaariset vesikkelit (sEV) ovat nanokokoisia rakkuloita, joita erittävät solut, jotka sisältävät nukleiinihappoja, proteiineja, pieniä molekyylejä ja muita komponentteja ja joilla on tärkeä rooli solujen välisessä viestinnässä. Eksosomi-tyyppiset pienet ekstrasellulaariset vesikkelit jakavat suuria yhtäläisyyksiä emosolujensa kanssa. Keinotekoisiin nanopartikkeleihin verrattuna niillä on alhaisempi immuunipuhdistuma ja alhaisempi sytotoksisuus, mikä tekee niistä lupaavia ehdokkaita uusina.in vivo -lääkekuljetusajoneuvot. Lähes kaikentyyppiset solut voivat erittää näitä rakkuloita, ja tutkimus niiden käytöstä lääkkeiden kantajina on vähitellen siirtymässä laboratoriosta kohti kliinisiä sovelluksia. Kuitenkin,suuri{0}}tuotanto on edelleen merkittävä pullonkaula.

 

Nykyiset menetelmät ekstrasellulaaristen rakkuloiden eristämiseen

Nykyiset ekstrasellulaariset rakkuloiden eristysmenetelmät sisältävätultrasentrifugointi, tiheysgradienttisentrifugointi, koko-ekskluusiokromatografia (SEC) ja polyetyleeniglykolisaostus (PEG).

PEG-saostus tarjoaa korkean tuoton ja yksinkertaisen toiminnan, mutta se liittyy merkittävään ei-toivottujen proteiinien kontaminaatioon. Tiheysgradienttisentrifugointi ja koko{1}}ekskluusiokromatografia voivat tuottaa erittäin-puhtaita tuotteita, mutta niiden tehokkuus on suhteellisen alhainen ja prosessit ovat aikaa-vieviä. Ultrasentrifugointia käytetään laajalti, mutta sen käsittelymäärää rajoittaa sentrifugin kapasiteetti, mikä vaikeuttaa sen mittakaavaa.

 

Tangentiaalisen virtaussuodatuksen soveltaminen sEV-erotukseen

Tangentiaalista virtaussuodatusta (TFF) on jo sovellettu nanopartikkelien, kuten liposomien ja lentivirusvektoreiden, erottamiseen. TFF:ssä syöttö virtaa tangentiaalisesti kalvon pinnan poikki, mikä auttaa vähentämään kalvon likaantumista ja helpottaa prosessin mittakaavaa.

Koska pienet ekstrasellulaariset vesikkelit vaihtelevat yleensä30-200 nmhalkaisijaltaan, a0,45 μm kalvokasettivoidaan valita TFF-järjestelmässä suurempien proteiinien ja rakkuloiden poistamiseksi, kun taas a300 kDa:n kalvokasettivoidaan käyttää pienmolekyylipainoisten-proteiinien poistamiseen ja viljelyalustassa olevien pienten ekstrasellulaaristen vesikkeleiden konsentroimiseen.

 

Raaka-aineen karakterisointi TFF-erotuksen jälkeen

Nanohiukkasten seurantaanalyysi (NTA) osoitti, että hiukkasten halkaisijat jakautuivat pääasiassa0-250 nm.

 

 

Transmissioelektronimikroskooppi (TEM) paljasti kuitenkin suuren määrän kontaminoivaa proteiinia, kun taas solunulkoisia rakkuloita ei havaittu. Nämä tulokset osoittivat, että ylimääräinen alavirran puhdistusvaihe vaadittiin solunulkoisten vesikkelien puhdistamiseksi edelleen.

 

TFF-konsentraatin karakterisointi 100 kDa:n ultrasuodatuksen jälkeen

TFF-konsentraattia käsiteltiin edelleen käyttämällä a100 kDa ultrasuodatusputki.

NTA osoitti, että yhden ja kahden ultrasuodatuskierroksen jälkeen saatujen rikasteiden hiukkasten halkaisijat pysyivät pääasiassa0-250 nm. Ultrasuodatuksen suorittaminen kahdesti johti kuitenkin saatujen hiukkasten lukumäärän merkittävään vähenemiseen.

TEM-analyysi osoitti, että vesikkeli{0}}kaltaisia ​​rakenteita ei havaittu yhden-- tai kaksi{2}}ultrasuodatuskonsentraateissa, kun taas huomattava määrä kontaminoivaa proteiinia jäi jäljelle.

Siksi100 kDa:n ultrasuodatusta ei voitu käyttää tehokkaasti elatusaineen puhdistamiseen TFF-konsentraation jälkeen.

 

 

Ultrasentrifugoinnilla puhdistetun TFF-konsentraatin karakterisointi

NTA osoitti, että puhdistettujen tuotteiden hiukkasten halkaisijat jakautuivat pääasiassa alueella0-250 nm.

TEM on tärkeää, että TEM paljasti selkeästi vesikkeli{0}}kaltaisia ​​rakenteita eri näkökentillä. Nämä tulokset osoittivat, että elatusaineen väkevöinnin jälkeen TFF:llä,ultrasentrifugointia voidaan myöhemmin käyttää ekstrasellulaaristen vesikkeleiden erottamiseen ja puhdistamiseen.

 

 

Mesenkymaalisten kantasolujen hoitoalustasta eristettyjen sEV:ien karakterisointi käyttämällä TFF:ää yhdistettynä ultrasentrifugointiin

NTA osoitti, että puhdistettujen tuotteiden hiukkasten halkaisijat jakautuivat pääasiassa alueella0-250 nm.

TEM havaitsi rakkula{0}}kaltaisia ​​rakenteita. Western blot -analyysi osoitti ekstrasellulaaristen vesikkeleihin liittyvien proteiinien positiivisen ilmentymisenCD9, CD63 ja ALIXpuhdistetuissa ekstrasellulaarisissa vesikkeleissä.

Nämä tulokset vahvistivat, että puhdistetut pienet ekstrasellulaariset vesikkelit sisälsivät eksosomeja, mikä osoittaa, että tätä menetelmää voidaan käyttää myöseksosomin eristäminen ja uuttaminen.

 

 

Johtopäätös: TFF yhdistettynä ultrasentrifugointiin korkealaatuiseen{0}}sEV-valmisteluun

Tutkimus osoitti senTFF-pitoisuus yksinjohti tuotteeseen, joka sisälsi huomattavan määrän kontaminoivia proteiineja ja oli siksi riittämätön kelvollisten ekstrasellulaaristen vesikkeleiden saamiseksi.

Samoin käyttämällä a100 kDa ultrasuodatusputki toissijaiseen puhdistukseeneivät tuottaneet tehokkaasti ehjiä vesikkelirakenteita.

Yhdistämällä TFF-konsentraatio myöhempään ultrasentrifugointipuhdistukseen, molempien tekniikoiden edut voidaan yhdistääkorkealaatuisia-pieniä solunulkoisia vesikkelituotteita.

Verrattuna tavanomaiseen ultrasentrifugointiin yksinään yhdistetty prosessi voi tehokkaastivähentää kokonaiskäsittelyaikaa ja parantaa erottelutehokkuutta.

Tässä työnkulussaTFF mahdollistaa suurten{0}}näytteiden nopean rikastamisen, jossa käsitellään tavanomaisen ultrasentrifugoinnin rajoituksia suurten näytemäärien käsittelyssä. Ultrasentrifugointi suorittaa sitten syväpuhdistuksen ko-konsentroituneiden proteiiniepäpuhtauksien poistamiseksi ja auttaa samalla säilyttämään vesikkelien puhtauden ja eheyden.

Lisäksi prosessi ei vaadi lisäämistäeksogeeniset kemialliset saostusreagenssit, auttaa säilyttämään rakkuloiden biologisen aktiivisuuden mahdollisimman suuressa määrin.

Teollisen kääntämisen näkökulmasta tämä prosessi on merkittäväskaalata -potentiaaliaja voi auttaa vastaamaan haasteisiin, jotka liittyvät solunulkoisten rakkuloiden laajamittaiseen tuotantoonlääkkeiden jakelu, regeneratiivinen lääketiede ja niihin liittyvä tuotekehitys. Se tarjoaa myös vankan kokeellisen perustan myöhempään prosessin optimointiin ja pilotti-mittakaavavalmistukseen.

 

Viite

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha et ai.Menetelmän luominen pienten ekstrasellulaaristen rakkuloiden erottamiseksi tangentiaalisella virtaussuodatuksella yhdistettynä ultrasentrifugointiin. Chinese Journal of Biologicals, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.